kwasy moje.docx

Biochemia

laboratorium

Ćwiczenie 4:

Kwasy nukleinowe

Sprawozdanie poprawione 27.06.2011

Katarzyna Kędzierska  144530
Sprawozdanie dodatkowe zaliczające nieobecność

kierunek Biotechnologia

grupa dziekańska: III

semestr: IV

data wykonania ćwiczenia: 24.03.201

data oddania sprawozdania 31.03.2011

1.     Wstęp teoretyczny:
Kwasy nukleinowe są to wielocząsteczkowe związki - podstawowe składniki wszystkich żywych komórek. Składają się one ze składnika cukrowego, zasady azotowej (purynowej lub pirymidynowej) i reszt kwasu ortofosforowego.
Kwasy nukleinowe dzielimy na:

·         Kwasy rybonukleinowe – RNA – zbudowane z β-D-rybofuranozy  połączonej wiązaniem glikozydowym z  zasadą purynową bądź pirymidynową, oraz wiązaniem estrowym z resztą kwasu ortofosforowego,

·         Kwasy deoksyrybonukleinowe – DNA – zbudowane z 2-deoksy-β-D-rybofuranozy  połączonej wiązaniem β-glikozydowym z zasadą purynową bądź pirymidynową, oraz wiązaniem estrowym z resztą kwasu ortofosforowego.

Składniki cukrowe kwasów nukleinowych:

β-D-rybofuranoza                                                                   2-deoksy-β-D-rybofuranoza 

Do podstawowych zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych należą:

a)      Zasady purynowe występujące zarówno w RNA jak i w DNA:

Adenina                                                                       Guanina               

b)      Zasady pirymidynowe, z których tymina występuje w DNA, uracyl zastępujący tyminę w RNA:

Cytozyna                           Uracyl                               Tymina

2.     Część doświadczalna:
 

2.1.   Rozpuszczalność kwasów nukleinowych:
 

a)      Wykonanie:

·         Do 0,5ml 0,1% roztworów RNA i DNA dodaliśmy kroplami 1N HCl, a następnie roztwór NaOH.

·         Do 1ml 0,1% roztworów DNA i RNA dodaliśmy podwójną objętość 96% etanolu.
 

b)      Obserwacje:

·         Po dodaniu kwasu solnego (1N) do probówek z roztworem RNA i DNA, w obu przypadkach, wytrącił się biały osad kwasów nukleinowych, który to następnie rozpuścił się po wprowadzeniu roztworu NaOH.

·         Po dodaniu etanolu (96%) do probówek, w których znajdowały się roztwory RNA i DNA, w obu przypadkach, wytrącił się biały osad kwasów nukleinowych.
 

c)      Wnioski:
Kwasy nukleinowe, ze względu na wielkość cząsteczek, tworzą w roztworach wodnych układy koloidowe, a dzięki dużej zawartości reszt kwasu ortofosforowego, mają odczyn kwaśny. Dzięki temu rozpuszczają się dobrze w środowisku zasadowym, natomiast dodanie kwasu i obniżenie pH roztworu doprowadza do odwracalnego wytrącenia kwasów nukleinowych. Tą właśnie właściwość kwasów nukleinowych obserwujemy w pierwszej części tego doświadczenia. Mianowicie po dodaniu, do 0,1% roztworów zawierających DNA lub RNA, kwasu solnego (czyli zakwaszeniu środowiska) wytrąca się biały osad kwasów nukleinowych, a po wkropleniu roztworu NaOH (czyli zalkalizowaniu środowiska), osad rozpuszcza się.  Również dodanie czynników odwadniających np. alkoholu powoduje wytracenie kwasów nukleinowych, co potwierdza druga cześć doświadczenia. Po wprowadzeniu 96% etanolu, do roztworów zawierających 0,1% roztwory DNA lub RNA, wytrąca się biały osad kwasów nukleinowych.
 

d)      Zasada metody:
W tym doświadczeniu, badamy właściwości kwasów nukleinowych, a dokładniej ich rozpuszczalność, poprzez zmianę pH roztworu (zakwaszenie środowiska 1N kwasem solnym, zalkalizowanie środowiska roztworem NaOH).
 

2.2.   Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych:
 

a)      Wykonanie:
We wrzącej łaźni wodnej ogrzewaliśmy 2,5ml 1% roztworu kwasów nukleinowych z 2,5ml 10% kwasu siarkowego (VI) w ciągu 1 godziny. Uzyskane w ten sposób hydrolizaty używaliśmy do kolejnych doświadczeń.
 

b)      Zasada metody:
Kwasy nukleinowe ogrzewane z kwasami mineralnymi ulegają hydrolizie do wolnych zasad purynowych i nukleotydów pirymidynowych. Z rozpadu nukleotydów purynowych w hydrolizacie znajduje się też kwas fosforowy i składnik cukrowy kwasów nukleinowych: ryboza i deoksyryboza.
 

2.3.   Wykrywanie pentoz w hydrolizatach kwasowych:
 

2.3.1. Reakcja orcynolowa:
 

a)      Wykonanie:
Do probówek zawierających po 1 ml:
1) hydrolizatu RNA
2) hydrolizaty DNA
3) 0,1% roztworu RNA
4) 0,1% roztworu DNA
5) 1% roztworu rybozy
6) 1% roztworu deoksyrybozy
dodaliśmy po 1ml odczynnika orcynolowego, a następnie umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po wyjęciu z łaźni i ostudzeniu do każdej próby dodaliśmy po 5ml wody destylowanej, a następnie określiliśmy barwę powstałego kompleksu.
 

b)      Obserwacje:
We wszystkich 6 probówkach pojawiło się zielone zabarwienie roztworu o różnych odcieniach.
 

c)      Wnioski:
We wszystkich probówkach stwierdzamy obecność pentoz (wolnych lub związanych w nukleozydach).
Ogrzewanie prób we wrzącej łaźni wodnej, ze stężonym kwasem solnym, zawarty w odczynniku orcynolowym, doprowadziło do odwodnienia zawartych w roztworach pentoz do furfuralu – cyklicznego aldehydu, który to z orcynolem (pochodną fenolową), w obecności jonów Fe3+ pochodzących również z odczynnika orcynolowego, utworzył barwne połączenie o barwie zielonej.
 

d)      Zasada metody:
Pentozy wolne oraz związane w nukleozydach, ogrzewane ze stężonym roztworem kwasu solnego przechodzą w furfural, który z oryną i jonami Fe3+ tworzy trwały kompleks o barwie zielonej.
 

e)      Równanie reakcji:

·         I etap reakcji: odwodnienie składnika cukrowego kwasów nukleinowych: rybozy pod wpływem stężonego kwasu solnego (zawartego w odczynniku orcynnolowym) do cyklicznego aldehydu: furfuralu


     ryboza
 

·         II etap reakcji: kondensacja cyklicznego aldehydu: furfuralu z dwoma cząsteczkami orcyny i utworzenie barwnego połączenia


   furfural        +   2 cząsteczki    →    barwny związek      +  2 cząsteczki
                                orcyny                                                              wody

2.3.2. Reakcja Dischego:
 

a)      Wykonanie:
Do probówek zawierających po 1 ml:
1) hydrolizatu RNA
2) hydrolizaty DNA
3) 0,1% roztworu RNA
4) 0,1% roztworu DNA
5) 1% roztworu rybozy
6) 1% roztworu deoksyrybozy
dodaliśmy po 2ml odczynnika difenyloaminowego, a następnie umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.
 

b)      Obserwacje:
W probówkach numer: 2, 4 i 6 pojawiło się niebieskie zabarwienie, natomiast w probówkach numer: 1, 3 i 5, roztwory pozostały bezbarwne.
 

c)      Wnioski:
W probówkach numer: 2, 4 i 6 wykryliśmy obecność DNA lub deoksyrybozy wolnej oraz związanej z zasadą purynową. Deoksyryboza w reakcji z difenyloaminą daje niebieskie zabarwienie, w przeciwieństwie do RNA i rybozy, które pozostają bezbarwne. Właściwość tą możemy wykorzystać do odróżnienia DNA od RNA (gdyż DNA zawiera deoksyrybozę, a RNA rybozę – nie barwiącą się w reakcji z difenyloaminą).
 

d)      Zasada metody:
DNA i deoksyryboza wolna oraz związana z zasadą purynową ulegają barwnej reakcji z difenyloaminą.
 

e)      Równanie reakcji:

 

2.3.3. Wykrywanie kwasu fosforowego:
 

a)      Wykonanie:
0,5ml hydrolizatu kwasu nukleinowego (DNA) zobojętniliśmy roztworem amoniaku, dodając 3 krople stężonego roztworu tego odczynnika. Następnie dodaliśmy 0,5ml stężonego roztworu kwasu azotowego (V) i 2ml molibdenianu amonowego. Zawartość probówek ogrzaliśmy do wrzenia.
 

b)      Obserwacje:
W probówce z hydrolizatem DNA wystąpiło wytrącenie się żółtego osadu.
 

c)      Wnioski:
W probówce z hydrolizatem DNA wykryliśmy obecność kwasu fosforowego. Potwierdza to fakt wydzielenia się żółtego osadu fosfomolibdenianu amonowego. Kwas ten był więc obecny w DNA.
 

d)      Zasada metody:
W obecności kwasu fosforowego, w reakcji tej, wytrąca się żółty osad fosfomolibdenianu amonowego.
 

2.4.   Wykrywanie zasad purynowych:
 

a)      Wykonanie:
Do 1ml hydrolizatu kwasu nukleinowego (RNA) dodaliśmy 6 kropli stężonego amoniaku i 3ml amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra.
 

b)      Obserwacje:
W probówce z hydrolizatem RNA nastąpiło wytrącenie się szarego osadu.
 

c)      Wnioski:
W probówce z hydrolizatem RNA wykryliśmy obecność zasad purynowych. Potwierdza to fakt powstania szarego osadu nierozpuszczalnych w amoniaku soli srebrowych puryn. Zasady purynowe były więc obecne w RNA.
 

d)      Zasada metody:
W obecności zasad purynowych, w reakcji tej, wytraca się nierozpuszczalny w amoniaku osad soli srebrowych puryn.
 

2.5.   Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną:
 

a)      Wykonanie:
Zasady purynowe oznaczaliśmy spektrofotometrycznie uzyskując je z kostek bulionowych.
Przygotowanie surowca do pomiaru spektrofotometrycznego:
Do 5g kostki bulionowej („Bulion na włoszczyźnie”) dodaliśmy około 75ml wody destylowanej, gotowaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut, a następnie po ostudzeniu przesączyliśmy do kolby miarowej o pojemności 100ml przez gazę młyńską i uzupełniliśmy wodą destylowaną do kreski. Po wymieszaniu roztwór jeszcze raz przesączyliśmy, ale tym razem przez sączek bibułowy. W tak przygotowanym roztworze oznaczyliśmy zawartość zasad purynowych (adeniny i guaniny) dokonując pomiaru absorbancji przy określonych długościach fali. W celu wyeliminowania wpływy zanieczyszczeń (np. aromatycznych aminokwasów) na wartość absorbancji, pomiar wykonywaliśmy przy dwóch długościach fali: maksymalnego pochłaniania (adenina przy 262, guanina przy 249) i przy 290 nm.
 

b)      Obliczenia i wyniki doświadczenia:
Tabela numer 1: Wyniki zmierzonej absorbancji roztworów (dla różnych kostek bulionowych).