ezn_kolo.doc

1.

Planowano badanie aktywności kompleksów fotosyntetycznych przy użyciu elektrody Clarka, mierzącej zmiany stężenia tlenu w zawiesinie błon tylakoidów. Postanowiono wypróbować następujące związki chemiczne mogące oddziaływać z błonami tylakoidów i kompleksami fotosyntetycznymi:

fenylo-p-benzochinon  E +150mV

kwas askorbinowy  E +60mV

metyloviologen  E -430mV

które z wymienionych związków można użyć jako donorów, a które jako akceptorów elektronów w łańcuchu fotosyntetycznym, jeśli wiadomo, że średni potencjał oksydoredukcyjny dla poszczególnych składowych fotosyntezy wynosi:

dla układu wydzielającego tlen  E +820mV

dla Q plastochinonu związanego w PSII, ostatniego akceptora ele w kompleksie PSII  E -150mV

dla centrum reakcji PSI  E +480mV

dla centrum żelazo-siarkowego, ostatniego akceptora elektronów w kompleksie PSI  E - 550mV

2.

Model kinetyki Michealisa- Menten został opracowany dla nieodwracalnej jednosubstratowej reakcji enzymatycznej. Jakie założenia należy przyjąć i w jaki sposób należy wykonać pomiary aby w prawidłowy sposób obliczyć stałe kinetyczne Km i Vmax dla wszystkich czterech reagentów dehydrogenazy mleczanowej (LDH), enzymu katalizującego odwracalną reakcję dwusubstratową. Jakie znaczenie ma w planowaniu doświadczenia ma informacja, że stała deltaG0 dla reakcji

mleczan +NAD+ <==> pirogronian +NADH+H+ deltaG0 = +6

Czy można określić mechanizm katalizowanej reakcji? Odpowiedź szczegółowo uzasadnić.

3.

Na kolumnie chromatograficznej oczyszczano dehydrogenazę mleczanową. W trakcie procedury eluowano z kolumny kolejne frakcje o objętości 1ml. We frakcjach badano aktywność enzymu poprzez pomiar zmian absorbancji przy 340nm. Do kolejnych kuwet zawierających odpowiedni bufor i substraty dodano:

I - 10ul pięciokrotnie rozcieńczonego eluatu nr1

II - 10ul nierozcieńczonego eluatu nr 2

III - 20ul nierozcieńczonego eluatu nr3

Końcowa objętość roztworu w kuwecie wynosiła 2ml

Zmiany absorbancji mierzono co 30sekund od momentu startu reakcji. Milimolowy współczynnik absorbancji dla nukleotydów nikotynoaminoadeninowych wynosi 6,22mM-1 cm-1. W tabeli podano średnie wartości pomiarów absorbancji:

Stężenie białka wyznaczono metodą Bradford w ten sposób, że do probówek zawierających 1,5ml odczynnika Bradford dodano po 10ul:

a) 5x rozcieńczonego eluatu nr 1

b) nierozcieńczonego eluatu nr 2

c) nierozcieńczonego eluatu nr 3

i 90 ul wody. Po 5minutach zmierzono absorbancję przy 595 nm uzyskując wartości absorbancji:

a) 0,3

b) 0,3

c) 0,6

Jednocześnie wyznaczono wg tego samego schematu krzywą wzorcową, uzyskując następujące wartości:

Na podstawie podanych danych obliczyć aktywność całkowitą i właściwą tych eluatów.